单县爱德万甜
酵母分泌嗦吗甜，是生产嗦吗甜另一种方法。植物嗦吗甜也由分泌产生，因 此可以模拟植物嗦吗甜的产生过程进行酵母嗦吗甜生产。而且植物和酵母的胞内 环境及输出蛋白折香、形成二硫键的细胞机制相似，因此可以推断分泌的嗦吗甜 也将具有甜味构型。将嗦吗甜丨、A、B的基因分别接在一密码序列的1末端， 该密码序列引导嗦吗甜进人细胞膜分泌途径，并最后分泌到培养基。
表5-6 基因工程法生产嗉吗甜
甜，产率为80%。
(二）利用半乳糖苷酶改性甜叶悬钩子苷
七、利用泡盛曲霉基因工程法生产嗦吗甜
六、甜菊苷的应用
钠溶液，合并到有机相中。无水硫酸钠十燥，过滤，蒸馏得6-甲基-3，4-二
没有人会想到，从一种粗陋且长期被忽略的植物果实中，提取出的蛋白质化 合物竞然会有甜味，而且很可能是地球上至今为止已发现的最甜的天然物质，更 没有人想到它竟然还有良好的风味改良效果。这种令人惊讶的天然物质就是本章 要重点讨论的嗦吗甜，它巳实现工业化生产并进人实用阶段。
(二）C-6羟基化学保护法（单基团保护法}
C.ti/而的基因组的DNA文库中分离得到3-磷酸甘油醛脱羧酸酶（GAP)基 因，其DNA序列测定后发现有一 1005hp的ORF片段0从C. utUis中得到的 GAP基㈥克隆至6.5kh ￡co/U片段。起始密码子上游的Ikb片段（-976? -1，推断+丨为翻译起始位点）作为启动子，用引物在V端加上N?d位点， 在3'端加上Xbal和BamHI位点。终止密码子下游0.7kb片段（+ 1006? + 1728)作为终止子，用引物在V端加上BamHI位点，在V端加上Pst丨位点， 将两片段在pBluescript SK的No丨丨和Pst丨位点间连接，构建得质粒pGAPPTIO (图5 - 15)。含单链莫奈林的0RF的0. 3kb的Dral - Bgl D片段插至pGAPPTIO 的平头Xbal位点和BamHI位点之间构建得PGAPM3。含rDNA片段的表达质 粒如下构建：从pCLRE2 (图5-14)中分离得到的含部分rDNA的1.2kb Apal 片段插至pBluescript SK的Apal位点构建得质粒pCRAl。在pCRAl的Xhol切 割平头端连接上Sphl连接体构建得pCRA2，在pCRAl的Asp7丨8切割平头端 连接上Notl连接体构建得pCRA3。pCRA3的1.2kh rDNA切割为0.5kb和 0. 7kh Notl - Bgl n片段后连接到质粒pUCBgl的Bgl n位点，构建得质粒 pCRA10o其中质粒pUCBgl由pUC19经EcoRI和HindHI酶切，并在Klenow酶 切处理后在切点处连接Bgl D连接体构建得到。质粒pCRA2经Sphl和EcoRI 酶切后，与由PCLRE16分离得到的含CYH抗性基因的1. Ikl, Sphl - KcoRI片 段连接构述得pCLR216。质粒pCRAlO经Xhol和Ps丨I酶切后，与含CYH抗性 基因的丨.1比？311-5&丨1片段（-184?+974)连接，构建得到pCRALll。从 PGAPM3分离得到的含莫奈林表达盒的2. Okb Notl - PstI片段插至pCLR216的 Notl和PstI位点构逑的质粒PCLRM216 (图5 - 16),插至pCRALl 1的Not丨和 PstI位点间构建得到质粒pKMll (图5-16)。C. W/is的URA3基因经与 的ura3突变子减基互补克隆得到，用作整合目标。URA3的801bP ORF 的 区域（+4?+356)和 3'区域（+356 ~+685)分別为 SaH-Bgin 和Bgl丨丨-AsP718片段，这两个片段插至pUC19的Sail和AsP718构建得质粒 pURAl0在pURAl的Hindffl酶切端和Asp718酶切平头端加上Not丨连接体分 别构建得到pURA2和PURA3。从pURA2的5,端分离得Noll - Bgl H片段，从 PURA3的1端分离得BglD - Notl片段，两片段连接至质粒pUCBg丨的Bgin位 点构建pURAlO。含CYH抗性基因的1. lkb PstI - Sail片段插至pURAlO的Sail 和PstI位点间，构建得pURALl 1。含莫奈林表达盒得2. Okb的Notl - PstI片段 插至pURALll的1^11和？8|丨位点间构建质粒pUMll (图5-16)。
