郾城区甜蜜素
达到稳定状态。这一空穴组成了一个有別于可容纳小分子甜味剂的两个活性位点 的二级结合部位。这个用于解释甜味蛋白相互作用机理，称为“楔形”模型， 最初楚在对Brazzein、莫奈林和嗦吗甜与受体的同源模型进行对接计算的基础上 提出来的。
3.受体蛋白活化构象受体蛋白，由于其识别部位通过离子键和氢键的相互作用，形成紧密的收缩 构象(the contracted conformation),该状态称为 R 状态(the resting state)，见图 1 -18n当甜味分子与受体蛋白相互作用后，两者形成分子间氢键，或者两者之间的 空间作用力，将可能导致受体蛋白识别部位之间部分离子键和氢键的断裂，从而 使受体蛋白紧密的收缩构象发生改变，形成更为开放的展开构象（the expanded conformation),称为受体蛋白的活化状态，见图1 - 19。某些强力甜味分子存在 高度结合部位如C02、CN、铵基或胍基，能够轻易破坏受体蛋白识別部位之间 的氢键，而且其分子上的环状刚性基团，像一个分子楔，合适地楔入识别部位 (即为空间楔入），也能使识别部位间的氢键断裂，因此具有强力甜味。
3-18所示，测定20g 4 - PAS分别与含2%、4%、6%、8%、10%乙酸的 lOOmL甲基异丁基酮回流3、3.5、4h的得率，以确定最佳乙酸浓度与反应时间。 由图可见，当在8mL乙酸/lOOmL溶液中反应3h,得率可达73.2%。另夕卜，
慢性试验测得小鼠的最大无作用量是550mg/kg,这相当于人体可能摄取量 的130倍。
图2 -54 在2年的毐性实验期间雄性和雌性大賦的体里变化在用纽甜所做的蜇要安全性试验中，并没有发现动物的临床病理指标、发病 率、死亡率的改变，或确定的器官毒性的表现。纽甜毐性试验时，所观察到关于 试验动物体里降低、体歌增长减慢是因为食物的可口性降低导致摄入减少所造成 的，并不是纽甜毒性作用的结果。
一、仙茅蛋白的化学结构
其中1997年，Kirin Co. ( Kanagawa,日本）的Kondo K等人的研究成果最为 引人注目。他们将人工合成的莫奈林基因克隆至产阮假丝酵母(CandUia utilis)细 胞内进行表达，莫奈林表达水平达到细胞可溶性蛋A的50%，莫奈林得率达 10mg/g湿酵母，该得率与从植物提取的最大得率相当，并且所得的莫奈林分离 纯化工艺非常简单，所用的C._7i5又是食用性酵母，因此采用该方法将能实现 英奈林的商业化生产，从而大大推进兑奈林的商业化开发进程。这里对该研究做 一介绍。
中数日。收集，水洗，再用lOOOmL水进行重结晶，干燥后可得晶体206g (熔点 150g),得率约82%。若再用甲醇重结晶一次，可得晶体199g (熔点 172-174*00为了最大限度地提髙纯度，最好再用甲醇敢结晶一次。
1976年，美国国家癌症研究所临时委员会在报道21个有关致癌性研究情况 时声明，“现有的证据不能证明甜蜜素和它的主要代谢产物环己胺对试验动物有 致癌作用”。
质粒pET-3a/SNase-SW转化至大肠杆菌BL21 (DE3) /pLysS菌株进行表 达。采用pLysS菌株可以消除引人前核酸酶的不利影响，更有利于核酸酶- Brazzein融合蛋白的表达。转换后在37T加人100|xg/mL阿司匹林、34jjig/mL氣 霉素的Luria培养基（LB)中培养一段时间后，加人IPTG后培养2~3h，大肠 杆菌中分子质萤23ku的融合蛋白产量达到最大，多数在内含体沉积，在16%的 Tricine凝胶中50%?70%的融合蛋白不溶。内含体蛋白经电泳凝胶提纯后，大 部分融合蛋白重新折黉(refolded),提纯纯度> 80%。经CNBi?处理后， 50%?70%融合蛋白发生解离，这说明融合蛋「丨不能完全解离。因Brazzein酸性 较强，p/约5.4，而核酸酶碱性较强，p/9.4，因此融合蛋白解离后用阳离子交 换色谱即能分离产物。纯化得到的重组Brazzein具有较高纯度及正确的分子质量 (6.4ku)0解离后得到的肽链与^-pGlul -Brazzein序列相同，甜度是植物提 取Brazzein的2倍，与从植物中分离得到的如-pGlul - Brazzein甜度相当。已 研究表明蛋白质只有在折垒正确时才具有甜味，未折垒(unfolded)或折奋错误
