思南县甜蜜素
(1)乙酰乙酰胺-/V-磺酰氟法：由氟磺酰异氰酸酯与各种活性亚甲基化合 物（包括炔、酮、/3-二酮、/3-酮酸、酮酯等）加成而形成中间体；或由氨 磺酰氟与双乙烯酮加成生成中间体，再经环化、成盐而获得产品。
图2 -23 401时，饱和缓冲溶液和水/有机溶剂二相体系中pH和 Z - Asp - PheOMe相对起始速率关系图 注：①--0-,表示在乙酸乙?炮和缓冲溶液的反应，緩冲液中落有0. 05rool/L Me? . NaOH, Snunol/LCaClj > 0.013mmol/L 嗜热箱务台柏.、80mn?oI/L PheOMe ? HCK 80mmol/L Z - jVsp；②?和漕，表示在以乙破乙?为有机溶射的水/有杌滚則二相体系中的反应；③參，表示在凍冲液pH7.0时，根梅在有机相的Z-Asp-PheOMe算得的起始速牟的相对苜分教；④表示根据在水相的Z - Asp - PheOMe算得的起始速芈相对苜分教；⑤虚线表示理论值a
表5 -11 构成莫奈林IV两条肽链的氨基酸顺序
Brazzein在植物甜蛋白中分子质虽最小，分子质萤约为6473u, p/为5。它 具有良好的水溶性，在水中的溶解度在50mg/mL以上，甜度是等质虽蔗糖的 2000倍。其结构相对简单并具有良好的热稳定性和PH稳定性，在较宽的1^和 温度范围内保持稳定，在80T保持4h甜度没有减弱，在85弋仍保持折叠形式, 在髙pH的溶液中仍保持甜味活性。它良好的热稳定性也许应归因于分子内的4 个二硫键。由于这些特性使其在食品添加剂中具有巨大的应用潜力，并成为研究 甜味蛋白分子结构、生化特性及甜味机制的理想蛋白模型。
催化反应的产物的彩响
B链的Asp残基被Asn替换后分别得到[ASnKl ]-莫奈林和[ASnw ]-莫 奈林的类似物，它们的甜度分别是蔗糖的7000倍和20倍，而用Abu替换Asp117 得到的类似物[Abi^]-莫奈林完全没有甜味。这表明：位于《-螺旋内的 Asp821被Asn替换后，可能会引起莫奈林分子构象的微小变化，或者更有利于结 合受体；ASpOT位于莫奈林分子内a-螺旋的起始部位，在分子的表面有游离的 办-竣基，能以离子键的形式与受体相结合，可能是莫奈林的活性部位； [Asnm]-莫奈林之所以也具有部分甜味，可能是Asn87与受体以氢键的形式相结 合的结果。此外，还对英奈林仅有的一个CySw的作用进行研究，结果发现：用 Ser替换Cy8w后，得到的[Ser8^ ]-莫奈林类似物的甜度是蔗糖甜度的2000 倍，并且该类似物在水溶液中的稳定性明显下降，与人工合成的莫奈林的构象略 有不同。可以肯定，Cys残基上的一SH基团在保持莫奈林的天然甜味构象方面 起着重要的作用。
0.3g/L0以重组酵母GS115/PPIC9M/PPIC3.5kV为出发菌株，通过摇瓶水平发酵 条件优化，高甜度莫奈林的分泌表达量进一步由0.3g/L提髙到了 0.5g/L。在 30L发酵罐上采取分批补料的方式实现了重组酵母GS115/pP丨C9M/PPIC3. 5kV的 高密度发酵，高甜度萸奈林分泌表达量达2g/L。而且表达的髙甜度萸奈林分泌 到胞外，无需破碎细胞提取。诙方法提供了一条产量高、分离纯化简便、可低成 本大规模生产高甜度英奈林的新途径，为实现髙甜度莫奈林的产业化和vgb基因 在毕赤酵母髙密度发酵中的广泛应用萸定了基础。
的呈味机理，以及寻找和开发新型强力甜味剂，都具有特殊重要的意义。
r, -二氣蔗糖的甜度是蔗糖的80倍。在-5弋下，用1，3, 5-三甲基 苯磺酰氣对蔗糖冇选择的磺酰化，保持6d,主要产物是6，r, 6^-三磺酰盐， 通过硅胶柱色谱分离得到期望的r, 二磺酰盐。将r, 6'-二磺酰盐乙酰 化，然后在二甲基甲酰胺中丨40T条件下，用氣化锂处理18h得到r，6^-二氣 化物，脱乙酰基后，得到丨、6^-二氣蔗糖。
由于S-6-a的氣化反应是化学反应，专一性不强，因此S-6-a直接氣化 后的体系组成较为复杂，既有二氣代产物、三氣代产物，还有各种蔗糖碎片及蔗 搪分子内脱水的产物。此时无论是直接从体系中分离出TGS-6-a，还是先去酯 化后再分离出三氣蔗糖，其分离操作都将极为繁杂且效率低下，不利于提髙三氣 蔗糖的得率。目前有一种更好的分离操作方法是：将S-6-a直接氣化后的产物先 进行全酯化反应，然后再以三氣-五乙酰基蔗糖酯（TGSPA)的形式结晶出来。
