北川县甘草甜素
近年來日本的Kirin公司已将莫奈林表达于产脘假丝酵母（C.u/i7/5)，这在 莫奈林的开发上已跨出重大的一步。与此同时，美国FDA已批准产脘假丝酵母 (C. utUis)为“公认的安全物质”（GRAS)。这一切将使莫奈林的研究开发和商 业推广获得新的转机。
势。虽然浓度髙达1%的甘草甜素溶液也很难抑制S.mu/a/M的生长，但细菌的依 附现象得到了很好的控制。如图4 -35所示，在有高浓度的甘草甜素溶液 (0.5% -1.0%)的作用下，细菌的依附现象几乎完全消失了。
叶中提取出6. 5%的甜菊苷。由此可见，提取法经济效益很差，因此许多研究人 员都在致力于通过化学途径使甜菊苷转化成甜菊双糖苷A的研究。
(二）天冬氨酸的改进
甜味与苦味相对比值为50: 17。有人正在进行结构改性方面的研究，以期改良其 甜味特性，消除苦后味。结果表明，Phyllodulcin的3-羟基-4-甲氧苯基团对 维持甜味十分重要，但酚羟基及内酯基团的消除对维持甜味没有影响。
尽管有很多强有力的试验数据和国际权威机构的卢明，一致认为甜蜜素作为 髙效甜味剂应用在食品中是安全的，而且，美国Abbott实验室向FDA的复议申 请一直持续到1990年。但是，已进入了 21世纪的今天，甜密素在美国的重新使 用看来是没有希望的。尽管如此，世界上尚有80多个国家并不仿效，依然批准 使用，我国卫生部也同意使用。1982年，世界食品添加剂联合专家委员会确定 的甜蜜素AD1值为11 mg/kg。
随后，许多卤化蔗糖衍生物被合成成功。r-氣蔗糖的甜度是蔗糖的20倍， 在二甲基甲酰胺中，用二甲氣基二苯硅烷处理，蔗糖c-r和c-2位首先被阻 碍，得到丨\ 2-二苯基亚甲硅基蔗糖衍生物，产量约为20%左右。.将剩余的6 个羟基团乙酰化后，用沸水乙酸把亚甲硅基断裂除去。在嘧啶中用三苯甲基氣化 物可对剩下的第一类羟基进行三苯甲基化作用，并且使剩余的第二类羟基乙酰 化，得到r-三苯甲基-蔗糖-7-醋酸盐。在冰醋酸中用溴化氢进行脱三苯甲 基作用，然后在嘧啶中用磺酰氣氯化，再在二甲基中酰胺中用氣化锂处理，最 后，在甲醇中用甲醇钠脱脂化得到r-氯庶糖。
(二）酶反应过程的动力学模型该合成反应中，甜菊苷与蔗糖经FFase催化生成FSte和葡萄糖。该反应双底 物、双产物，并且同时有副反应发生，反应机制相当复杂。Chamber!等认为，蔗 糖和呋喃果聚糖的转果糖基反应，符合乒乓（BiBi)机制。Suzuki等认为，S和蔗 糖的转果糖基反应也符合相同的机制（图4-21)，并对该反应建立了动力学模型。 该反应中，游离爾E和蔗糖Sue反应形成第一个复合物E ? Sue。然后G从E ? Sue 释放形成第2个复合物E ? Fru，该复合物与S反应形成第3个复合物E ? FSte，随 后FSte释放。在该系统除转果糖基作用外，还同时进行蔗糖水解和FSte水解反应。 这些水解反应若把水看作第二底物，则也符合乒乓（BiBi)机制，如图4-21 (2) 和（3)所示。根据研究认为FSte的合成不仅受到G的抑制，还受到F的抑制， 因此必须考虑G和F的竞争性抑制作用，并认为酶和副产物的复合物E ? Glu和 E* Fru呈惰性。FSte合成的总反应的理论机制如图4-22所示，A,?屺分别表示一 级反应的速率常数。图4-21各反应的乒乓（BiBi)机制示意图 (1) FSte合成反应 <2>蔗糖水解反哚 (3) FSte水解反应
后来，Goodman等人建立了新的模型，其模型合并了 Termissi模型的大部分 内容，不同之处只在于一些空间方面的内容。这一模型特别地是用来优化二肽甜 味剂的结构-活性关系理论的。图1-丨6 (2)所示为此模型。在模型中，Shal- lenberger的AH-B系统位于+)轴，Kier的AH、B、X理论中相应的疏水基团 X则可以占据空间的几个K域。Goodman等人认为，这些疏水基闭的定位对于决
0.3g/L0以重组酵母GS115/PPIC9M/PPIC3.5kV为出发菌株，通过摇瓶水平发酵 条件优化，高甜度莫奈林的分泌表达量进一步由0.3g/L提髙到了 0.5g/L。在 30L发酵罐上采取分批补料的方式实现了重组酵母GS115/pP丨C9M/PPIC3. 5kV的 高密度发酵，高甜度萸奈林分泌表达量达2g/L。而且表达的髙甜度萸奈林分泌 到胞外，无需破碎细胞提取。诙方法提供了一条产量高、分离纯化简便、可低成 本大规模生产高甜度英奈林的新途径，为实现髙甜度莫奈林的产业化和vgb基因 在毕赤酵母髙密度发酵中的广泛应用萸定了基础。
